NK细胞高效扩增试剂盒

【产品名称】NK细胞高效扩增试剂盒

【产品组成】试剂盒套装货号：661070

套装内容	数量	单位	保存条件	产品性状
NK Cell Culture Medium (661071)	2	瓶	2-8℃	液体
NK-A (661072)	1	支	-20℃	液体
NK-B (661073)	1	支	-20℃	液体
NK-C (661074)	1	支	-20℃	液体
NK-D (661075)	1	支	-20℃	液体
NK-E (661076)	1	支	-20℃	冻干粉
NK-F (661077)	1	支	-20℃	冻干粉

【1. 产品介绍】
Ø 本产品是一款NK细胞高效扩增的试剂盒。。外周血/脐带血中的PBMC/CBMC细胞经本试剂盒处理后，在14-16天时间内，2L体系细胞总数可达到6×10⁹-8×10⁹，细胞存活率90%以上，NK细胞比例最高可达90%以上。
Ø 本试剂盒适用于人外周血/脐带血和经过血细胞单采仪处理获得的白细胞等来源的样品。
Ø 本试剂盒是在符合相关规范的无菌环境中生产，并已通过了严格的细菌、真菌、支原体、病毒（HIV、HAV、HBV、HCV）、内毒素检测。本试剂盒不含血浆、动物源成分以及其他不明确成分。
【2. 用户需要自行准备的试剂耗材】
0.4%苔盼蓝、生理盐水、人淋巴细胞分离液、肝素钠（锂）采血管或100ml采血袋、PBS、75cm²悬浮培养瓶、175cm²培养瓶、细胞培养袋、15ml/50ml/250ml离心管、移液管、5ml和50ml无菌注射器等。

【3. 样本采集及运输要求】

3.1、外周血样本采集应为肝素钠采血管，脐带血优先选择100ml采血袋，采集过程应严格规范无菌。实际采血总量应大于50ml，采集后血液与抗凝剂应及时混匀。
3.2、样本运输条件为18-25℃，24小时处理样本。

【4. T75培养瓶包被】
4.1、在75CM²悬浮培养瓶中加入8ml生理盐水和1支NK-A，用电动移液器吹打充分混匀；
4.2、让混合液在培养瓶表面均匀分布；
4.3、在 37℃ 二氧化碳培养箱中水平放置120-150min；
4.4、小心取出混合液，包被后的培养瓶应立即使用，不可剧烈晃动。

【5. PBMC的分离和血浆制备（以50ml样本THERMO ST16离心机为例）】
5.1 将 50ml 血液样本均分至2个50ml离心管，3000rpm，10min，取上层血浆转移至新的离心管，56℃，30min 灭活，4℃静置10min，3000rpm，10min进行离心，用吸管将上清液转移至新的离心管中，-20℃分装保存，使用前取出；
5.2 剩下细胞加入生理盐水至原体积，充分混合均匀，转移至2个装有15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温下1800rpm，30min；
5.3 取出PBMC/CBMC至新的50ml离心管；加入生理盐水至45ml，1600rpm，8min；
5.4 去上清，加入生理盐水至45ml，充分混匀，取样计数；
5.5 1400rpm，10min 收集PBMC/CBMC。

【6. 完全培养基使用说明】
6.1 第一瓶培养基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-E (661076)，充分混匀，配置成完全培养基，使用前恢复至室温；
6.2 第二瓶培养基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-F (661077)，充分混匀，配置成完全培养基，使用前恢复至室温；
6.3 按顺序配置使用
【7. 细胞接种】
7.1 取包被瓶，去包被液待用；
7.2 取45ml完全培养基，加入一支NK-B和5ml自体血浆混匀；
7.3 用混匀后的完全培养基重悬已经收集好的单个核细胞；调整细胞密度1.5-2.0×106cell/ml；（如初始细胞总数较少，按比例降低接种细胞体积,初始细胞总数不超过1×10⁸cell/ml）
7.4 D0（指接种当天）转移混匀后的细胞悬液至包被瓶，转移过程中不可快速冲刷T-75培养瓶处理面，应从侧面缓慢加入后，再缓慢平放于培养箱中培养。
【8. 补液】
8.1 D3，镜下观察有较多克隆团出现，即可补液，如有大量较大的克隆团，可适当打散（下同），  转移细胞至T175培养瓶中，补加45ml完全培养基，一支NK-C和5ml自体血浆混匀；
8.2 D5，补加110ml完全培养基，加入一支NK-D和10ml自体血浆，混匀；
8.3 D7，补加200ml完全培养基和10ml自体血浆，混匀，转入细胞培养袋；
8.4 D9，分袋，先将培养袋中细胞取一半均分到新的细胞培养袋中， 然后将400ml完全培养基和10ml自体血浆，混匀，均分到2个培养袋中；自体血浆如用完可不添加或用细胞营养添加物替代（下同）；
8.5 D11，往细胞培养袋中分别补加300ml完全培养基和5ml自体血浆，混匀；
8.6 D13，往细胞培养袋中分别补加300ml完全培养基5ml自体血浆，混匀；
8.7 如需扩大培养体系（如3L、4L、6L、8L），使用 NK-F 因子配置的完全培养基继续补液培养即可；
8.8 整体根据细胞密度适当补液，补液后细胞密度不低于1.5×10⁶cell/ml。
【9. 收获】
收获NK细胞，可根据实验情况，适当提前或延迟。

【注意事项】
1、 整个补液过程中，每次接种或补液体积因样本、增值速度、初始细胞总数等会发生变化，应维持补液后密度不低于1.5×106cell/ml；出现较多较大细胞团可适当打散，说明书7中的补液流程可根据实际细胞状况做调整。
2、 分袋时间：根据试验的便利性，培养袋里面液体总体积达到1000-1500ml时分袋也可以，不局限于8.4中提到的D9天的分袋时间。
3、 细胞培养袋中总体积在1500-1600ml能最大发挥培养基效果，不宜过满，当总体积过大还需要继续补液培养时应及时分袋培养。