NKT细胞高效扩增试剂盒

【产品名称】NKT细胞高效扩增试剂盒

【产品组成】试剂盒套装货号：665070

【1. 产品介绍】
1.1本产品是一款 NKT 细胞高效扩增的试剂盒套装。
1.2本产品适用于人外周血/脐带血和经过血细胞单采仪处理获得的白细胞等来源的样品。
1.3本产品是在符合相关规范的无菌环境中生产，并已通过了严格的细菌、真菌、支原体、病毒（HIV、HAV、HBV、HCV）、内毒素检测。

【2. 材料和设备】
用户需要自行准备的试剂耗材：
0.4%苔盼蓝溶液、生理盐水、人淋巴细胞分离液、肝素钠（或锂）采血管或 100ML 采血袋、PBS、T75cm² 悬浮培养瓶、T175cm² 培养瓶、细胞培养袋、15mL/50mL/250mL 离心管、移液管、5mL 和 50mL无菌注射器等。

【3. 样本采集及运输要求】
3.1 外周血样本采集应为肝素钠采血管，脐带血优先选择 100ml 采血袋，采集过程应严格规范无菌。实际采血总量应大于 50ml，采集后血液与抗凝剂应及时混匀。
3.2 样本运输条件为 18-25℃，24 小时处理样本。

【4. PBMC 的分离和血浆制备（以 50ml 样本 THERMO ST16 离心机为例）】
4.1 将 50ml 血液样本均分至 2 个 50ml 离心管，3000rpm，10min，取上层血浆转移至新的离心管，56℃， 30min 灭活，4℃静置 10min，3000rpm，10min进行离心，用吸管将上清液转移至新的离心管中，-20℃分装保存，使用前取出；
4.2 剩下细胞加入生理盐水至原体积，充分混合均匀，转移至 2 个装有 15ml 淋巴细胞分离液的 50ml离心管中，室温下 1800rpm，30min；
4.3 取出 PBMC/CBMC 至新的 50ml 离心管；加入生理盐水至 45ml，1600rpm，8min；
4.4 去上清，加入生理盐水至 45ml，充分混匀，取样计数；
4.5 1400rpm，10min 收集 PBMC/CBMC。

【5. 完全培养基配置说明】
5.1 第一瓶培养基｛NKT Cell Culture Medium (665071)｝加入一支 NKT-E (665076)，充分混匀，配置成完全培养基，使用前恢复至室温；
5.2 第二瓶培养基｛NKT Cell Culture Medium (665071)｝加入一支 NKT-F (665077)，充分混匀，配置成完全培养基，使用前恢复至室温；
5.3 按顺序配置使用。

【6. 细胞接种】
6.1 D0（指接种当天），取 40ml 完全培养基加入 NKT-A(665072)和 NKT-B(665073)以及 5ml 自体血浆混匀待用；
6.2 用6.1配置的培养基重悬已经收集好的单个核细胞；调整细胞密度 1.5-2.0×10⁶cell/ml；（如初始细胞总数较少，按比例降低接种总体积，初始接种细胞总数不超过1×10⁸cell/ml）
6.3 转移混匀后的细胞悬液至T75cm² 悬浮培养瓶，混匀，再缓慢平放于培养箱中培养。

【7. 补液】
7.1 D3，镜下观察有较多克隆团出现，即可补液，如有大量较大的克隆团，可适当打散（下同），转移细胞至 T175 cm²培养瓶中，补加 40ml 完全培养基，一支 NKT-C 和 5ml 自体血浆混匀；
7.2 D5，补加 80ml 完全培养基，加入一支 NKT-D 和 5ml 自体血浆，混匀；
7.3 D7，补加 140ml 完全培养基和 5ml 自体血浆，混匀；
7.4 D9，补加 300ml 完全培养基和 5ml 自体血浆，混匀；转入细胞培养袋，自体血浆如用完可不添加或用细胞营养添加物替代（下同）；
7.5 D11，往细胞培养袋中补加600ml完全培养基和5ml自体血浆，混匀；
7.6 D13，分袋，每个细胞培养袋补加400ml 完全培养基和 5ml 自体血浆，混匀；
7.7 如需扩大培养体系（如3L、4L、6L、8L），使用 NKT-F 因子配置完全培养基继续补液培养即可。
7.8 整体根据细胞密度适当补液，补液后细胞密度不低于 1.5 x 10⁶ cell/ml；

【8. 收获】
 收获 NKT 细胞，可根据实验情况，适当提前或延迟。

注意事项
1、 整个补液过程中，每次接种或补液体积因样本、增值速度、初始细胞总数等会发生变化，应维持补液后密度不低于1.5×10⁶cell/ml；出现较多较大细胞团可适当打散，说明书7中的补液流程可根据实际细胞状况做调整。
2、 分袋时间：根据试验的便利性，培养袋里面液体总体积达到1000-1500ml时分袋也可以，不局限于7.6中提到的D13天的分袋时间。
3、 细胞培养袋中总体积在1500-1600ml能最大发挥培养基效果，不宜过满，当总体积过大还需要继续补液培养时应及时分袋培养。